Aprovechamiento de los subproductos del brócoli como fuente de compuestos bioactivos

Los subproductos y su valorización

La industria agroalimentaria es actualmente uno de principales motores de desarrollo económico en el mundo, siendo la Región de Murcia una potencia en la producción de frutas y hortalizas. 

El procesamiento de estos productos genera una cantidad ingente de subproductos que, en la mayoría de los casos, no tienen ninguna aplicación en la producción de nuevos alimentos o productos, y son desechados suponiendo un problema medioambiental. 

Existen algunos usos de estos subproductos como la producción de biomasa y piensos para alimentación animal, pero ninguno garantiza una eficiente utilización de este material que puede ofrecer interesantes posibilidades para la industria agroalimentaria y la reducción del problema medioambiental. 

Sin embargo, hoy en día existen numerosas referencias acerca del potencial que poseen los subproductos de la industria agroalimentaria como fuente importante de compuestos bioactivos, aunque apenas se ha explorado este potencial de forma específica en los subproductos del brócoli. 

Figura 1. El cultivo del brócoli está ampliamente extendido en España. 

Objetivo: ingredientes bioactivos a partir de subproductos del brócoli

Por ello, el principal objetivo de esta tesis doctoral se ha centrado en desarrollar un sistema de producción sostenible de ingredientes bioactivos apostando por la valorización de los subproductos del brócoli (hojas y tallos) generados en grandes cantidades por la empresa Agrícola Santa Eulalia SL, mediante el empleo de tecnologías de extracción respetuosas con el medioambiente, para su incorporación a la fabricación de nuevos productos con aplicaciones cosméticas y nutracéuticas. 

Para conseguirlo se propusieron otros objetivos concretos como el establecimiento de las condiciones óptimas del procesado de los subproductos antes de la extracción de los compuestos bioactivos y la optimización de las técnicas de extracción de los compuestos bioactivos de interés para la salud humana. 

Además, se estudió la bioactividad de los extractos obtenidos frente a dos líneas celulares (queratinocitos y miofibroblastos de colon). También se propuso así comprobar el efecto fotoprotector de los extractos en queratinocitos expuestos a radiación UV-B, además de estudiar los mecanismos protectores desencadenados por los extractos enriquecidos en compuestos bioactivos y su efecto reparador en heridas superficiales sobre esta línea celular.

Figura 2. Las hojas y los tallos del brócoli, que no se destinan al consumo humano tienen elevado contenido en ingredientes bioactivos. 

De la misma forma, se propuso estudiar el efecto citotóxico de los extractos obtenidos de los subproductos de brócoli sobre la línea de células de colon sano, así como los mecanismos protectores de los extractos enriquecidos en compuestos bioactivos sobre esta línea celular expuesta a lipopolisacárido, un componente de las membranas celulares de las bacterias Gram negativas que colonizan el intestino y que al liberarse es capaz de desencadenar un proceso inflamatorio tanto en el intestino mismo, como en otras partes del organismo, en el caso de que la barrera intestinal se encuentre dañada.

Optimización del procedimiento de extracción

De esta forma, una vez optimizado el protocolo de triturado y deshidratado del subproducto de brócoli, se llevó a cabo una extracción convencional usando para ello disolventes orgánicos como el metanol y el cloroformo para obtener los compuestos bioactivos de interés para la salud humana (β-caroteno, compuestos fenólicos totales, clorofilas, fitoesteroles, α-tocoferol y glucosinolatos). 

Esta extracción convencional se llevó a cabo a partir de mezclas de hoja y tallo en diferentes proporciones, dando como resultado una mayor cantidad de compuestos bioactivos totales en la muestra formada por una mezcla de hoja y tallo en proporción 3:1, que además resultó ser la proporción más representativa de los subproductos en el campo tras la recolección de las pellas. 

Además, esta proporción fue la que mayor capacidad antioxidante presentó de todas las estudiadas.

Una vez seleccionada la fracción de hoja/tallo 3:1 como la idónea para la obtención de compuestos bioactivos se desarrolló un diseño experimental basado en el modelo de superficie de respuesta para optimizar y validar los procedimientos de extracción de compuestos bioactivos mediante fluidos supercríticos (SFE) y líquidos presurizados (PLE). 

La identificación y cuantificación de los compuestos bioactivos se realizó mediante HPLC-DAD, HPLC-MS, GC-MS y espectrofotométricamente, determinando, además, la capacidad antioxidante de los extractos obtenidos mediante el método del ABTS. 

Figura 3. La extracción de los compuestos bioactivos se realiza con técnicas como la de fluidos supercríticos o líquidos presurizados. 

Para la optimización de la SFE se llevó a cabo una batería de experimentos con diferentes condiciones de extracción y se optimizó el proceso en base a la cantidad de β-caroteno obtenido y se demostró que la temperatura, la presión, el tiempo de procesamiento, el flujo y el porcentaje de etanol influyeron significativamente en la extracción, dando como resultado un extracto mucho más rico en compuestos bioactivos totales (β-caroteno, compuestos fenólicos totales, clorofilas, fitoesteroles y α-tocoferol) que los extractos convencionales, lo que a su vez se correlacionó con una mayor actividad antioxidante. 

Por otro lado, puesto que la SFE no fue capaz de extraer los glucosinolatos de los subproductos del brócoli, se llevó a cabo la optimización de la extracción de estos compuestos mediante PLE. 

En este caso, la temperatura de la extracción fue la que demostró tener un efecto significativo en la recuperación de los glucosinolatos, demostrando la eficiencia de PLE como una alternativa ambientalmente sostenible para extraer glucosinolatos a partir de los subproductos del brócoli.

Caracterización y bioactividad de los extractos de brócoli

Una vez caracterizados los compuestos bioactivos presentes en los extractos obtenidos por SFE y PLE, se realizaron ensayos de bioactividad in vitro para evaluar si el pretratamiento con estos extractos procedentes de subproductos de brócoli era capaz de reducir el estrés oxidativo causado por la exposición a la luz UV-B en una línea celular de queratinocitos no tumorigénicos (HaCaT), así como un sistema de protección frente a la inflamación intestinal inducida por el lipopolisacárido (LPS) en una línea celular de miofibroblastos sanos de colon (CCD-18Co). 

Para ello, en primer lugar, se determinó la citotoxicidad de los extractos frente a ambas líneas celulares y a distintos tiempos de tratamiento. 

Una vez conocida la cantidad máxima de extractos que no produjo un descenso significativo de la viabilidad se determinó el efecto fotoprotector de los extractos obtenidos por SFE en la línea celular de queratinocitos expuesta a dos dosis de radiación UV-B (25 y 50 mJ/cm²). 

Los resultados indicaron que, si bien la viabilidad celular no se recuperó por la presencia de los extractos SFE tras la radiación con UV-B, sí que se observó una reducción significativa de la producción intracelular de especies reactivas de oxígeno (ROS) inducidas por la radiación UV-B en las células tratadas con todas las concentraciones de los extractos (0,1 a 50 µg ml^-1), siendo además la concentración más alta utilizada, capaz de reducir la expresión de estas ROS  a niveles basales de queratinocitos sin irradiar con UV-B.

Figura 4. Los extractos del brócoli son capaces de reducir el estrés oxidativo causado por la exposición a la luz UV y la inflamación intestinal. 

Posteriormente, con la misma línea de queratinocitos se determinaron los perfiles de transcripción de genes que codifican para citoquinas proinflamatorias (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α y COX-2) inducidas por UV-B mediante qRT-PCR. 

Los resultados mostraron que, todos los genes de las citoquinas proinflamatorias estudiadas se vieron afectadas por el tratamiento con UV-B, a excepción de IL-8

Además, todas las concentraciones del extracto SFE exhibieron un efecto citoprotector sobre los queratinocitos expuestos a la luz UV-B reduciendo significativamente el aumento de las citoquinas proinflamatorias IL-1β, IL-6 y TNF-α tras 14 horas de la irradiación, mientras que solo las concentraciones usadas menores a 10 µg ml^-1 hicieron lo mismo con COX-2. 

Estos resultados indicaban que los extractos ricos en compuestos bioactivos obtenidos por SFE podrían ser usados tópicamente como buenos agentes antiinflamatorios contra los efectos producidos por la radiación UV-B.

Finalmente, con la misma línea de queratinocitos se estudió el posible efecto reparador de heridas superficiales de los extractos obtenidos por SFE y PLE. 

Tras la incubación con los extractos se realizó una herida en la monocapa de queratinocitos y se determinó la velocidad de migración de las células y el cierre de la herida durante 48 horas. 

Tras este tiempo, se comprobó que los extractos obtenidos por SFE fueron capaces de aumentar significativamente el porcentaje de cierre de la herida en comparación con las células control. 

En el caso de los extractos obtenidos por PLE, el porcentaje de curación de la herida tras 48 horas también fue significativamente mayor con todas las concentraciones de los extractos utilizadas y la velocidad de migración de las células también se vio aumentada en algunos casos. 

Estos resultados indicaban que sería posible el uso de ambos tipos de extractos para el tratamiento de cicatrización de heridas superficiales de la piel.

Por otra parte, el extracto enriquecido en glucosinolatos obtenido mediante PLE se aplicó a células de colon expuestas a lipopolisacárido (LPS). Los resultados indicaron que estos extractos fueron capaces de disminuir la cantidad de ROS intracelulares producidas por la exposición a LPS hasta niveles de células sin exponer cuando se usaron los extractos a concentraciones altas (500 y 1000 µg ml^-1). También se determinaron las propiedades antiinflamatorias de los extractos obtenidos por PLE en miofibroblastos de colon sanos expuestos a LPS. 

Los resultados obtenidos indicaron que los extractos usados mostraron que, en este caso, la exposición a LPS fue capaz de afectar significativamente a la expresión de todos los genes relacionados con la inflamación estudiados (IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α y COX-2). 

Además, a pesar de presentar diferentes tendencias en cuanto a tiempo y concentración, todas las concentraciones de los extractos de PLE demostraron su capacidad para atenuar la producción de los marcadores proinflamatorios, por lo que se podría indicar el uso nutracéutico de estos extractos para tratar los efectos inflamatorios producidos por el LPS presente en las bacterias que colonizan el colon y que son capaces de causar procesos inflamatorios incluso en otras partes del organismo.

Figura 5. Los extractos de los subproductos del brócoli tienen potencial como nuevos ingredientes o aditivos para la producción de productos cosméticos y nutracéuticos.

Conclusión

Todos estos resultados descritos demuestran que los extractos obtenidos mediante técnicas de las denominadas verdes, como es la extracción mediante fluidos supercríticos y la extracción mediante líquidos presurizados, procedentes de subproductos de brócoli tienen una prometedora utilidad potencial como nuevos ingredientes o aditivos para la producción de productos cosméticos y nutracéuticos. 

Además, esta revalorización de los subproductos de brócoli permitirá a la empresa Agrícola Santa Eulalia dar un salto cualitativo en su gama de productos, revalorizando a su vez un subproducto derivado de su propio proceso de producción.